摘要：采用砂基培養(yǎng)法，研究硒對(duì)鉛、汞脅迫下大豆生長的影響。對(duì)大豆幼苗的株高、結(jié)瘤率、植株根系所在沙質(zhì)培養(yǎng)基pH、葉片干重、葉綠素、葉片丙二醛含量、葉片脯氨酸（Pro）含量、葉片光合效率植株葉片相對(duì)電導(dǎo)率以及保護(hù)酶POD活性的影響。結(jié)果表明，鉛、汞脅迫下大豆植株矮化，重金屬毒害使葉片失綠，干重降低，葉片 MDA 含量增加，POD 活性增強(qiáng)，硒可減輕鉛和汞對(duì)于大豆的毒害，表現(xiàn)為: 
本試驗(yàn)以大豆為材料, 通過砂基培養(yǎng), 旨在探討硒對(duì)鉛和汞脅迫下大豆生長和生理特性的影響, 以探討硒能否抑制或緩解鉛和汞對(duì)大豆的毒害。
關(guān)鍵詞：硒 重金屬 脅迫 生長影響
英文摘要：
英文關(guān)鍵詞：selenium, heavy metal pollution, stress, soybean
 
1.前言：
大豆起源于中G，在中G栽培并用作食物及藥物已有5000年的歷史。大豆呈橢球形、球形，顏色有黃色、淡綠色、黑色等，故又有黃豆、青豆、黑豆之稱。大豆?fàn)I養(yǎng)豐富，含多種營養(yǎng)成分和生物活性成分，大豆含蛋白質(zhì)約40%、脂肪20%、碳水化合物20%、粗纖維5%，并含多種礦物質(zhì)和纖維素，營養(yǎng)價(jià)值很高。近些年來，人們發(fā)現(xiàn)大豆中有多種具有保健功能的成分，如大豆多肽，大豆低聚糖，大豆膳食纖維及大豆磷脂等，這些成分具有延年益壽、延緩衰老、降血壓、降血脂、抗癌等功能。目前，已從傳統(tǒng)的豆制品（豆腐、腐乳、豆?jié){）生產(chǎn)到工業(yè)化的豆制品生產(chǎn)，如大豆油，豆奶，大豆組織蛋白及大豆異黃酮，大豆卵磷脂等大豆保健品。
硒是廣泛存在于自然界中的一種元素，它是人體內(nèi)不可缺少的微量元素，缺硒是人體克山病、大骨節(jié)病的主要原因，會(huì)導(dǎo)致人及動(dòng)物免疫功能下降，加重心腦血管病、糖尿病、癌癥、克山病和鎘中毒。^[1] 重金屬污染是當(dāng)今極受人們重視的環(huán)境污染問題之一。^[2] 鉛(Pb)在環(huán)境中普遍存在，隨著都市化、現(xiàn)代化進(jìn)程的加快,鉛已經(jīng)成為我們生活中**常見的化學(xué)污染物。鉛的多親和性和蓄積性使得它進(jìn)入人體后可引起人體許多器官的功能紊亂,包括神經(jīng)、造血、消化系統(tǒng)及腎臟,同時(shí)還損害人體的免疫系統(tǒng),使機(jī)體抵抗力下降。^[3] 汞(Hg)是一種廣泛分布于環(huán)境中的劇毒重金屬，^[4] 是一種高毒性重金屬元素,但是由于其特殊的物理化學(xué)性質(zhì),在工業(yè)上又有著多種重要用途而被大量生產(chǎn)和使用,給環(huán)境帶來了嚴(yán)重的影響。汞在環(huán)境中主要以單質(zhì)汞(Hg)、無機(jī)汞(Hg⁺、Hg⁺²鹽及其配合物)和有機(jī)汞(烷基汞、苯基汞)的形態(tài)存在。各種形態(tài)在自然環(huán)境中可以發(fā)生多種生物轉(zhuǎn)化和化學(xué)轉(zhuǎn)化,并通過食物鏈富集,對(duì)人類和動(dòng)物造成極大的危害。^[5]而近些年的研究發(fā)現(xiàn)，硒具有促進(jìn)植物新陳代謝和植物對(duì)環(huán)境脅迫的抗性，并具有拮抗重金屬的作用，^[6]人們發(fā)現(xiàn)硒有拮抗鉛毒性的作用:一方面硒是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要組成成分,能明顯改善鉛中毒誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),減輕鉛的危害;另一方面硒與金屬有很強(qiáng)的親和力,可在體內(nèi)與鉛結(jié)合形成金屬硒蛋白復(fù)合物,從而可降低鉛的毒性作用。^[3] 隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，我G土壤環(huán)境質(zhì)量發(fā)生了極大變化,土壤污染日益嚴(yán)重,目前我G受鎘、砷、鉻、鉛等重金屬污染的耕地面積近2000萬hm²,約占總耕地面積的20 %，除耕地污染外,我G的工礦區(qū)、城市也存在土壤(或土地)污染問題。因此,結(jié)合目前開展的全G**土壤污染普查以及G外**新研究成果,制定有效的土壤環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)體系,對(duì)于預(yù)防和治理土壤污染,改善土壤質(zhì)量尤為重要。
在現(xiàn)行《食用農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》中，土壤中的總鉛定為≤80mg/kg，土壤中汞定為1.0mg/kg(pH＞7.5).近年來 ,美G、英G、澳大利亞等G在研究鉛在土壤中的允許含量時(shí)，不采用通常的以食物鉛的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)作為依據(jù)，而是以鉛對(duì)兒童的毒害、劑量 ——效應(yīng)關(guān)系及血鉛與土鉛的關(guān)系作為制定土壤環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)。研究表明 ,當(dāng)土壤鉛含量大于100mg/kg 時(shí) ,兒童血鉛含量則大于15μg/100mL,這對(duì)兒健康產(chǎn)生了不良的影響，因此我G環(huán)境土壤標(biāo)準(zhǔn)中制定的鉛臨界值遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏高 ,難以保障兒童的健康發(fā)展。重金屬通過食物鏈進(jìn)入人體。對(duì)重金屬毒害shou當(dāng)其沖的是植物。研究表明，適量的硒添加可以緩解重金屬對(duì)植物的毒害，所以研究硒對(duì)鉛、汞脅迫下大豆的生長影響是很有必要的。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定在硒元素作用下，大豆在重金屬鉛、汞脅迫下其結(jié)瘤率、株高、葉片干重（鮮重）、葉綠素含量、脯氨酸含量、葉片丙二醛含量、光合效率以及過氧化物酶（POD）活性的變化，探究硒元素對(duì)鉛、汞脅迫下大豆生長的影響。從而探討重金屬與植物的逆境生理關(guān)系。
2.材料與方法
2.1實(shí)驗(yàn)材料及處理
   本實(shí)驗(yàn)采用大豆為研究對(duì)象。選取飽滿種子消毒，25℃浸種24h催芽2天，移栽于處理過的粗砂培養(yǎng)基內(nèi)，分為空白組、A組、B組、C組及H組，各組處理見表1
表1 實(shí)驗(yàn)各組處理

用Hoagland培養(yǎng)液每2天澆灌一次，每次5mL.每2天滴加重金屬鉛和汞，各5mL.
2.2營養(yǎng)液及處理液的配制
表2 Hoagland營養(yǎng)液系列成分（1000mL）

	藥品	劑量	配制量（mL）	貯存液	用量（mL）
大量元素	KNO3#p#分頁標(biāo)題#e#	0.607g/L	1000	20倍	50
	NH4H2PO4	0.115 g/L	1000	20倍	50
	MgSO4·7H2O	0.493 g/L	1000	20倍	50
	Ca(N03)2·4H2O	0.945 g/L	1000	20倍	50
微量元素	H3BO3	2.86 mg/L	1000	1000倍	1
	MnCl2·4H2O	2.13 mg/L
	ZnSO4·7H2O	0.22 mg/L
	(NH4)6Mo7O24·4H2O	0.02 mg/L
	CuSO4·5H2O	0.08 mg/L
半微量元素	Fe-EDTA	6.51mg/L	500	500倍	1

2.3主要儀器及試劑
2.3.1主要儀器
智能光照培養(yǎng)箱（SPX-GB型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）
電子天平（AL204型，梅特勒-托利多儀器有限公司）
分光光度計(jì)（722型，上海光譜儀器有限公司）
高速離心機(jī)（TGL-20B C型，上海安亭科學(xué)儀器廠）
電熱恒溫水浴鍋（DK-S24型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）
電導(dǎo)率儀（DDS-307A型，上海精密科學(xué)儀器有限公司）
智能光照培養(yǎng)箱（SPX-GB型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）
電子天平（AL204型，梅特勒-托利多儀器有限公司）
分光光度計(jì)（722型，上海光譜儀器有限公司）
高速離心機(jī)（TGL-20B C型，上海安亭科學(xué)儀器廠）
電熱恒溫水浴鍋（DK-S24型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）
電導(dǎo)率儀（DDS-307A型，上海精密科學(xué)儀器有限公司）
ph計(jì)（PHS-3D型，雷磁）
2.3.2主要試劑
30%過氧化氫、80%乙醇、丙酮、茚三酮試劑、人造沸石、石英砂、碳酸鈣、冰醋酸、三氯乙酸、標(biāo)準(zhǔn)脯氨酸溶液、硫代巴比妥酸（TBA）溶液（用10%TCA配制0.6%的TBA溶液）。
2.4 實(shí)驗(yàn)方法
2.4.1實(shí)驗(yàn)植物大豆的植株苗長
 
2.4.2實(shí)驗(yàn)植物大豆的根冠比
 
2.4.3實(shí)驗(yàn)植物大豆植株葉片丙二醛含量
稱取大豆葉1.0g，加入10%TCA2mL和少量石英砂研磨成勻漿后，進(jìn)一步加入10%TCA8mL于研缽中充分研磨，勻漿液移入5mL的離心管中，一4000r/min離心10min，收集上清液2mL再加入0.6%TBA混勻在試管上加蓋置于沸水浴中煮沸15min，迅速冷卻離心。以2mL水為空白對(duì)照，取上清液測(cè)，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定在450nm、532nm和600nm下的OD值。計(jì)算公式如下：
C(μmol/L)=6.45（A₅₃₂-A₆₀₀）-0.56A₄₅₀；
MDA含量(μmol/g)=C×V×10^-3/W.
式中：C——丙二醛的濃度(μmol/L)；V——提取液總體積（mL）；
  W——樣品質(zhì)量（g）
2.4.4實(shí)驗(yàn)植物大豆植株葉片脯氨酸（Pro）含量的測(cè)定^[7][7]
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：吸取脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)母液0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL分別放入7支具塞刻度試管，分別加入蒸餾水**2.0mL，其脯氨酸含量分別為0，2.0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.0μg.分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)液2mL，加冰醋酸2mL，茚三酮試劑2mL加入試管中，混勻后加玻璃球賽，在沸水浴中加熱15min。用分光光度計(jì)于515nm下進(jìn)行比色測(cè)定，以零濃度為空白對(duì)照。將測(cè)定結(jié)果以脯氨酸濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
植株樣品液的提取：選取植株功能葉片1.0g，用3mL80%乙醇研磨（放少許石英砂）成勻漿。用2mL80%乙醇洗滌研缽，將提取物和洗液**于試管中，加蓋于黑暗中溫室下提取24h。將提取液在放有活性炭的濾紙上進(jìn)行過濾，重復(fù)過濾一次，記下體積。將濾液置于試管中加其重量1/5的人造沸石強(qiáng)烈震蕩5min。將上層液在離心機(jī)上以4000r/min離心10min上清液備用。
   樣品溶液的測(cè)定：取2mL上清液置于試管中，再加入2mL冰醋酸和2mL茚三酮試劑，加蓋密封在沸水浴加熱15min。用3mL80%乙醇代替樣品液作為對(duì)照。在分光光度計(jì)上測(cè)510nm處各樣品的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求樣品液中脯氨酸含量。
         脯氨酸[μg/g(干或鮮樣)]=（C×V_T/A）/W
（注：C---由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的脯氨酸的質(zhì)量（μg）；V#p#分頁標(biāo)題#e#_T---提取液總體積；A---測(cè)定液體積（mL）；W---樣品質(zhì)量（g）
 
2.4.5實(shí)驗(yàn)植物大豆植株葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定^[8]
稱取大豆0.5g，加入純丙酮5mL，再加入少許碳酸鈣和石英砂于研缽中研磨成勻漿后加入80%丙酮3mL繼續(xù)研磨，將研磨液移入10mL離心管中，并用2mL80%丙酮洗滌研缽，后一并導(dǎo)入，以3000r/min離心10min，收集上清液并用80%丙酮定容**20mL。取上清液1mL，加入80%丙酮4mL，以80%丙酮為對(duì)照。采用分光光度法, 在波長為645nm、663nm下測(cè)定。計(jì)算公式如下：
C_a=12.7OD₆₆₃-2.69OD₆₄₅；
C_b=22.9OD₆₄₅-4.68OD₆₆₃；
C_T=C_a+C_b=8.02OD₆₆₃+20.21OD₆₄₅；
葉綠素的含量（mg/g）=[葉綠素的濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)]/樣品鮮重（或干重）。
（注：Ca、Cb、 C_T分別表示葉綠素a、葉綠素b、總的葉綠素，單位為mg/L）計(jì)算。
 
2.4.6實(shí)驗(yàn)植物大豆植株葉片超氧化物歧化酶（POD）的測(cè)定^[7]
稱取植物材料0.1g，加20mmol/L KH₂PO₄ 0.5mL于研缽中研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入1.5mL的離心管中。用0.5mL20mmol/L KH₂PO₄溶液沖洗研缽后也轉(zhuǎn)入上述離心管中。12000r/min離心10min，上清液即為粗酶提取液。
取光徑1cm比色杯2只，于一只中加入反應(yīng)混合液3mL，上述酶20uL（如酶活性過高可適當(dāng)稀釋）混勻后立即開啟秒表計(jì)時(shí)，從**分鐘開始于分光光度計(jì)470nm波長下讀取OD值，每隔1min讀數(shù)一次，連續(xù)讀數(shù)3分鐘。以每分鐘OD變化值表示酶活性大小，即以△OD470/min·mg蛋白質(zhì)（或鮮重g）表示。 
2.4.7實(shí)驗(yàn)植物大豆植株葉片相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定
稱取用蒸餾水洗凈葉片污物的大豆兩份，每份1.0g,分別放在100mL的編號(hào)為A和B的兩個(gè)燒杯中，各加入50mL的蒸餾水。A杯常溫處理，B杯稱重后蓋上表面皿，煮沸10-15min,冷卻后再稱重并加蒸餾水**原重量。把兩杯在室溫下放置24h后，用電導(dǎo)率儀測(cè)A杯、B杯兩杯的電導(dǎo)率，即用電導(dǎo)率法測(cè)定。按下列公式計(jì)算：
R（%）=（R₁/R₂）*100
2.4.8實(shí)驗(yàn)植物大豆植株光合效率的測(cè)定；
用Handy PEA儀器測(cè)定
2.4.9實(shí)驗(yàn)植物大豆植株結(jié)瘤率的測(cè)定；
 
2.4.10實(shí)驗(yàn)植物大豆植株根系所在沙質(zhì)培養(yǎng)基pH的測(cè)定。
用ph計(jì)測(cè)定
3 結(jié)果與分析
3.1鉛對(duì)大豆生長的影響
3.1.1鉛對(duì)大豆植株苗長的影響
3.1.2鉛對(duì)根冠比的影響
3.1.3 鉛對(duì)丙二醛（MDA）含量的影響
3.1.4 鉛對(duì)脯氨酸（Pro）含量的影響
3.1.5 鉛對(duì)葉綠素含量的影響
3.1.6 鉛對(duì)過氧化物酶（POD）的影響
3.1.7 鉛對(duì)電導(dǎo)率的影響
3.1.8 鉛對(duì)光合效率的影響
3.1.9 鉛對(duì)結(jié)瘤率的影響
通過硒對(duì)鉛脅迫下的豌豆在種子的萌發(fā)、植株的生長、根尖細(xì)胞分裂及生理代謝等方面的研究表明,低濃度的硒能緩解一定濃度的鉛毒害,增強(qiáng)植物的抗逆境脅迫能力。如當(dāng)鉛濃度 ≤100 mg/ L時(shí),≤1. 0 mg/ L硒可促進(jìn)鉛脅迫下豌豆根尖細(xì)胞分裂,使種子加速萌發(fā),加快幼苗生長;加入適宜濃度的硒后,硒通過保護(hù)葉綠體ATPase活性,提高葉片的葉綠素含量,增強(qiáng)植物的光合作用,從而起到解毒效應(yīng)。而解毒效應(yīng)與維持植物體內(nèi)酶活性平衡密切相關(guān)。在鉛濃度≤100 mg/ L時(shí),≤1. 0 mg/ L硒使植物體內(nèi)使活性氧的清除和生成處于相對(duì)的低水平平衡狀態(tài),內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,確保了各種生理活動(dòng)的正常進(jìn)行,從而表現(xiàn)出防護(hù)作用。但抗氧化酶的保護(hù)作用是有一定限度的,當(dāng)硒濃度大于5. 0 mg/ L時(shí),硒則與鉛共同脅迫,致使代謝出現(xiàn)紊亂,各種生命活動(dòng)受到嚴(yán)重抑制。所以,農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可用硒做微肥施用,抑制植物吸收鉛等重金屬,減少它們進(jìn)入食物鏈,從而降低鉛污染的危害,也可提高植物的含硒量,補(bǔ)充和改善人畜硒營養(yǎng)水平。^[9]
3.2 汞對(duì)大豆生長的影響
3.2.1汞對(duì)大豆植株苗長的影響
3.2.2汞對(duì)根冠比的影響
3.2.3 汞對(duì)丙二醛（MDA）含量的影響
3.2.4 汞對(duì)脯氨酸（Pro）含量的影響
3.2.5 汞對(duì)葉綠素含量的影響
3.2.6 汞對(duì)過氧化物酶（POD）的影響
3.2.7 汞對(duì)電導(dǎo)率的影響
3.2.8 汞對(duì)光合效率的影響
3.2.9 汞對(duì)結(jié)瘤率的影響
 
3.3 鉛和汞對(duì)大豆生長的影響
4 討論
5結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄：
實(shí)驗(yàn)所用主要儀器及相關(guān)藥品
1.實(shí)驗(yàn)植物大豆的植株苗長
儀器：直尺
2.實(shí)驗(yàn)植物大豆的根冠比
儀器：剪刀、電子天平
3.實(shí)驗(yàn)植物大豆植株葉片丙二醛含量
儀器：722型分光光度計(jì)、比色皿、高速離心機(jī)、離心管、電子天平、研缽、恒溫水浴鍋、具刻度試管、剪刀、移液管、移液槍
藥品：三氯乙酸（TCA）、石英砂、硫代巴比妥酸（TBA）
4.實(shí)驗(yàn)植物大豆植株葉片脯氨酸（Pro）含量的測(cè)定
儀器：高速離心機(jī)、離心管、電子天平、研缽、恒溫水浴鍋、具刻度試管、剪刀、移液管、移液槍、722型分光光度計(jì)、恒溫水浴搖床
藥品：冰醋酸、人造沸石、活性炭、磷酸、脯氨酸、無水乙醇、茚三酮
5.實(shí)驗(yàn)植物大豆植株葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定
儀器：高速離心機(jī)、離心管、電子天平、研缽、恒溫水浴鍋、具刻度試管、剪刀、移液管、722型分光光度計(jì)
藥品：丙酮、碳酸鈣、石英砂 
6.實(shí)驗(yàn)植物大豆植株葉片超氧化物歧化酶（POD）的測(cè)定#p#分頁標(biāo)題#e#
儀器：高速離心機(jī)、離心管、電子天平、研缽、具刻度試管、移液管、722型分光光度計(jì)、秒表