摘要： 目的    研究大孔吸附樹脂分離純化那他霉素發酵液的工藝，提高那他霉素成品質量，得到高純度藥用級那他霉素。方法    用HPLC檢測方法，以那他霉素的洗脫率為指標，考察大孔樹脂分離純化那他霉素的吸附性能和洗脫參數。結果    那他霉素從發酵液中的**佳溶出pH值為11；分離純化那他霉素的有效吸附劑為大孔吸附樹脂HZ816，其動態吸附量為150mg/mL，解吸收率在90%以上，成品純度大于98%。結論    該高純度藥用級那他霉素的規模化分離純化方法為G內**應用，工藝簡單可靠，分離效果好，適于工業化生產。
關鍵詞： 那他霉素；大孔吸附樹脂；分離純化
中圖分類號：     文獻標識碼： A
 
Studies on Separation and Purification of Natamycin by Macroporons Resin
 
 
Wang Hai-yan, Li Xiao-lu, Wang Jian, Zhang Li, Lin Yang, Zhang Jin-juan, Zhang Xue-xia
(New Drug Research & Development Company of NCPC, National Engineering Research Center of Microbial Medicine, Shijiazhuang 050015)
 
Abstract   Objective   The method that separation and purification of high-purity Natamycin for pharmaceutical use from fermentation broth by macroporous resins was studied. Methods   Based on adsorption capacity and elution efficiency of Natamycin, the conditions to separation and purification of Natamycin by macroporous resins were optimized. Results   The optimum pH value for releasing Natamycin from the fermentation broth was 11. HZ816 was selected as the effective macroporous adsorbent for separation and purification of Natamycin from fermentation broth. The desorption rate of Natamycin was over 90% and the purity of the final product was over 98% under the optimal conditions. Conclusion   This method about separation and purification of high-purity Natamycin for pharmaceutical use was discovered for the first time and was warranted for the commercial process.
Key words   Natamycin; Macroporous resin; Separation and purification
 
那他霉素是一種多烯大環內酯類抗真菌抗生素，是一種白色**乳白色幾乎無臭無味的結晶粉末。分子式C₃₃H₄₇NO₁₃，分子量為665.73。化學結構式如下：
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
圖1    那他霉素的結構式
Fig. 1    The structure of natamycin
 
那他霉素是那塔爾鏈霉菌(Streptomyces natalenis)、恰塔努加鏈霉菌(Streptomyces chattanoogensis)或褐黃孢鏈霉菌(Streptomyces gilvosPoreus)等微生物的次生代謝產物，從發酵液中提取純化后獲得。那他霉素是一種高效、低毒的具有廣譜的抗霉菌、酵母菌、某些原生動物和藻類劑，可以用于醫療、食品、飼料、糧儲防霉，特別是在食品原料保鮮、食品防腐等方面具有良好的使用^{[1, 2]}。
那他霉素是兩性物質，分子中含有一個堿性基團和一個酸性基團，其電離常數pKa值為8.35和4.6，相應的等電點為6.5。由于那他霉素含有4個相連的雙鍵結構，決定了那他霉素幾乎不溶于水，微溶于甲醇，溶于冰醋酸^[3]。由于那他霉素的溶解特性，很多用于那他霉素分離的工藝為溶媒提取結晶和物理分離^{[4, 5]}。這些提取過程使用的溶劑量大，損耗大，成本高，很難實現規模化生產。
本文采用大孔吸附樹脂從發酵液中將目的產物分離、富集、結晶、干燥，在G內**實現了規模化的高純度藥用級那他霉素的分離純化，產品質量符合G家藥典要求，收率穩定，設備投資少，適于工業化生產。
1    儀器與材料
高效液相色譜儀（996檢測器，515泵，Waters公司）； Loborata 4000旋轉蒸發器（Heidolph公司）；PHS-3c型酸度計（上海雷磁儀器廠）；TGL-16G高速離心機（上海安亭科學儀器廠）。
那他霉素發酵液（華藥集團新藥公司生物工程室提供）；那他霉素標準品(購自美GSigma公司)。大孔樹脂D312、DA201、HZ816、HZ801（上海華震科技有限公司），大孔樹脂 Amberlite XAD16HP (美G羅門哈斯公司) ，大孔樹脂X-5、AB-8(安徽三星樹脂科技有限公司)，大孔樹脂HPD-100(天津海光化工有限公司)；去離子水（本實驗自制）；乙腈（色譜純，美GMerk公司）；工業乙醇（滄州興隆化工有限公司）；其他試劑均為G產分析純。
2    方法與結果
2.1    HPLC法測定那他霉素的含量
色譜柱：Extend C₁₈ (4.6×250mm, 5µm)；流動相：乙腈-水-0.01 mo1/L醋酸銨緩沖溶液(70︰30)；流速：1.0mL/min；檢測波長：303nm；進樣量：10µL。那他霉素保留時間為9.2min。
2.2  發酵液預處理及溶液pH值對那他霉素溶出率的影響
2.2.1    發酵液預處理  由于那他霉素主要存在于菌絲體內，且發酵液中雜質較多，不利于直接進行樹脂吸附。shou先在發酵液中加入7%的珍珠巖，攪拌30min后真空抽濾，水頂洗，得那他霉素菌絲體。#p#分頁標題#e#
2.2.2    溶液pH值對那他霉素溶出率的影響  提高那他霉素的成品質量和成品收率，菌絲體內那他霉素的溶出率是關鍵因素，為此根據那他霉素的兩性特征，shou先考察不同pH值下那他霉素的溶出率，找到**佳溶出條件。將那他霉素菌絲體在不同pH值的水中攪拌2h，HPLC在線檢測，其**佳溶出pH值見圖2 (25℃) 。
 

 
 
圖2    pH對那他霉素溶出率的影響
Fig. 2   　Effect of different pH on dissolution rate to natamycin
 
從圖2 中可以看出，pH接近中性和偏低時不利于那他霉素的溶出，而pH過高對那他霉素有分解作用，本實驗中確定pH=11為**佳溶出pH。
2.3    樹脂的吸附和解吸
2.3.1    吸附條件的考察
2.3.1.1    樹脂的預處理及再生  先用丙酮充分浸泡樹脂，除去色素和雜質，并用蒸餾水洗滌，**洗滌液加丙酮不變渾為止。然后用4倍樹脂體積的2mol/LHCl 溶液攪拌浸泡4h，用蒸餾水洗**中性。再用4倍樹脂體積的2mol/LNaOH 溶液攪拌浸泡4h，洗**中性備用。再生的方法與預處理基本相同。
2.3.1.2    樹脂的篩選  取預處理好的不同型號的大孔吸附樹脂各100mL裝柱，從上端加入那他霉素菌絲體浸提濾液，流速為2BV/h樹脂床體積，并以HPLC在線檢測出口液濃度，當出口液濃度接近上樣液濃度10%時，認為樹脂已吸附飽和并停止上樣，計算吸附容量。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
圖3    不同型號樹脂對那他霉素吸附量的比較
　Fig. 3  　 Comparision of absorption capacity of natamycin absorbed by different macroporous resins
 
根據那他霉素弱極性的特性，選用D312、DA201、HZ816、HZ801、Amberlite XAD16HP、X-5、AB-8和HPD-100等8種非極性大孔吸附樹脂，在pH為7.0的條件下進行動態吸附篩選，結果見圖3。
由圖3可以看出，Amberlite XAD16HP大孔樹脂具有**佳吸附性能，其次為HZ816大孔樹脂。鑒于Amberlite XAD16HP大孔樹脂為進口品，價格昂貴，因此確定用G產HZ816大孔樹脂吸附分離那他霉素。其動態吸附量約為150mg/mL。
2.3.1.3    吸附pH的考察  將一定量的那他霉素浸提液分別調節成不同pH，然后使用HZ816樹脂吸附，考察pH對HZ816樹脂吸附量的影響，結果見圖4。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
圖4    pH值對HZ816樹脂吸附量的影響
Fig. 4   　Influence of pH on the adsorption capacity by macroporous resin HZ816
 
由圖4可以看出，在pH為7.0時，吸附量**大。這跟那他霉素的穩定性有一定關系，那他霉素在pH 3-9中具有活性，在pH 5-7范圍內穩定且活性**強。pH低于5, 那他霉素水解失去碳霉糖，并從四烯變為五烯結構，并引起那他霉素完全降解；pH高于9，那他霉素皂化降解。因此，那他霉素的**佳吸附pH為7.0。
2.3.1.4    吸附流速的考察  將一定量那他霉素浸提液分別以不同流速上HZ816樹脂柱吸附，考察不同流速下HZ816樹脂的吸附性能，結果見圖5。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
圖5    上樣液吸附流速對HZ816樹脂吸附性能的影響
Fig. 5    Effect of different velocities of sample solution on adsorption capacity by HZ816
 
由圖5可見，流速越慢，吸附越好。但流速過慢會延長生產周期，提高成本，因此采用中速即1.5-2.5BV/h樹脂床體積作為吸附流速。
2.3.2    解吸條件的考察  選用甲醇、乙醇、丙酮等3種溶劑，采用靜態吸附解吸的方法進行篩選。結果表明，乙醇和甲醇具有較好的解吸能力。由于乙醇毒性低于甲醇，因而選用乙醇作為解吸劑。
為了提高解吸收率，使洗脫高峰集中，將飽和樹脂(120mL)用水、40%乙醇凈化后，再用不同pH的氫氧化鈉溶液和乙醇的混合液解吸，洗脫流速為0.5BV/h，實驗結果見表1。
 
表1    洗脫條件的優化
Tab. 1    Optimization of the elution conditions
 

pH	60%乙醇		80%乙醇		90%乙醇
	體積（mL）	解吸率(%)	體積（mL）	解吸率(%)	體積（mL）	解吸率(%)
7	800	97.3	500	96.2	450	95.4
9	650	97.0	380	96.8	350	94.6
11	500	96.5	300	95.7	300	94.1
13	400	95.1	300	94.8	300	93.8

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由表1可知，pH=11的80%的乙醇溶液洗脫峰**集中，收率**高。而更高濃度的氫氧化鈉由于堿性過大，破壞了那他霉素結構，收率明顯降低。
2.4    結晶
用1mol/LHCL溶液調節濃縮液pH**5.0-6.5，使那他霉素沉淀析出，冷庫靜置12h，離心分離，得到那他霉素濕粉，用去離子水洗**中性，干燥，得那他霉素乳白色粉末，HPLC含量為98.3%。
3    討論
本實驗采用大孔吸附樹脂HZ816分離純化那他霉素，其吸附率和解吸率高，洗脫液中色素和雜質少，且洗脫高峰集中。重復3批實驗，解吸收率均大于90%，成品純度大于98%，成品折純收率大于65%，說明HZ816樹脂適合于高純度那他霉素的提取分離。此外，該方法生產成本低，安全性高，收率穩定，具有較高的應用價值。